Cancerul colorectal are o patogeneză complexă, care implică atât factori de mediu, cât și factori genetici, reprezentați de acumularea diverselor mutații genetice și epigenetice.

În ciuda eficienței programelor de screening în reducerea mortalității și morbidității asociate cu CRC, aproximativ 20–23% dintre pacienți sunt diagnosticați inițial cu cancer colorectal metastatic (CRCm), având o rată de supraviețuire la 5 ani de aproximativ 13%. În acest context, stabilirea profilului molecular al tumorii are un rol esențial.

Conform ghidurilor NCCN, analizele genetice pentru CRC sunt recomandate înainte de inițierea tratamentului și includ detecția mutațiilor în genele RAS și BRAF.

Gena BRAF codifică o serin/treonin-kinază cu rol fundamental în proliferarea tumorală, diferențiere, angiogeneză și metastazare. Prezența mutațiilor BRAF în CRC, similar mutațiilor RAS, este asociată cu rezistența la terapia țintită cu anticorpi monoclonali anti-EGFR.

Testarea mutațiilor BRAF este de importanță majoră pentru stabilirea conduitei terapeutice la pacienții cu CRC metastatic. În acest scop au fost dezvoltate numeroase tehnologii de diagnostic molecular, printre care și metoda Real-Time PCR, utilizată în cadrul laboratorului nostru. Aceasta permite identificarea corectă și rapidă a mutațiilor V600, inclusiv V600E, în gena BRAF, din probe de țesut tumoral incluse în parafină (FFPE).

Afecțiuni și simptome asociate:

Cancerul colorectal reprezintă o afecțiune malignă a ultimei porțiuni a tubului digestiv, care cuprinde colonul (intestinul gros) și rectul. Boala se poate dezvolta la nivelul colonului — cancer de colon, sau la nivelul rectului (segmentul terminal al colonului) — cancer rectal.

Afecțiunile asociate cancerului colorectal includ:

• boli inflamatorii intestinale (boala Crohn, colita ulcerativă);
• polipi adenomatoși (care pot degenera în cancer);
• sindroame ereditare (polipoză adenomatoasă familială, sindrom Lynch);
• obezitate;
• diabet zaharat.

Complicațiile cancerului colorectal pot include ocluzii intestinale, perforații, sângerări severe și anemie.

Manifestările clinice întâlnite la pacienții cu tumori maligne colorectale sunt variate și pot include:

• tulburări ale tranzitului intestinal, de la constipație la diaree;
• modificarea aspectului materiilor fecale;
• prezența de sânge în scaun sau eliminarea de sânge proaspăt pe cale rectală;
• distensie abdominală gazoasă;
• senzația de defecație incompletă;
• dureri abdominale;
• fatigabilitate și stare generală de slăbiciune;
• pierdere în greutate neintenționată.

De asemenea, pot apărea și alte semne sistemice: oboseală excesivă, slăbiciune fizică inexplicabilă, pierdere ponderală semnificativă, icter sclero-tegumentar, edeme ale membrelor inferioare și/sau superioare, precum și fracturi osoase spontane — manifestări posibile ale stadiilor avansate de cancer colorectal.

Cui se adresează analiza

Testarea mutației BRAF se adresează pacienților diagnosticați cu cancer colorectal (fără mutații în genele KRAS și NRAS), în vederea personalizării strategiei de tratament și a stabilirii conduitei terapeutice optime.

Metodologie de testare

Testul presupune extracția ADN din țesut tumoral inclus în parafină (FFPE), urmată de cuantificarea acestuia prin metode spectrofotometrice și fluorimetrice, pentru determinarea calității și a cantității probei.

Ulterior, ADN-ul este amplificat prin tehnologie Real-Time PCR, metodă ce permite detecția precisă și rapidă a mutațiilor localizate la nivelul codonului 600 din gena BRAF.

Beneficii și importanță clinică

Caracterizarea moleculară a cancerului colorectal metastatic (CRCm) este esențială pentru alegerea terapiilor care vizează direct particularitățile biologice ale tumorii, în subseturi specifice de pacienți.

Diagnosticarea timpurie a CRC crește speranța de viață și șansele de remisie completă în urma tratamentului adecvat. Screeningul cancerului colorectal este recomandat tuturor persoanelor începând cu vârsta de 50 de ani, sau mai devreme la cei cu antecedente personale ori familiale de boală neoplazică colorectală.

La pacienții cu CRC, testarea BRAF împreună cu testarea RAS reprezintă o etapă consacrată a diagnosticului molecular, efectuată înaintea inițierii terapiei de primă linie, conform ghidurilor internaționale actuale (ASCO / ESMO / NCCN).

Mutațiile activatoare BRAF – mutații „driver” în CRC – sunt:

• întâlnite la 5–12% dintre pacienții cu CRC metastatic; peste 90% dintre aceștia prezintă mutația BRAF V600E, mutual exclusivă cu mutațiile RAS;
• asociate frecvent cu:
  • sexul feminin,
  • vârsta înaintată (>70 ani),
  • stadiu avansat de boală (metastaze peritoneale și ganglionare la distanță),
  • localizare proximală a tumorii,
  • adenoame serate sesile,
  • rezistență la schemele de tratament standard,
  • prognostic nefavorabil;
• variabile ca prevalență și impact terapeutic, în funcție de tipul de cancer.

Importanța detecției mutațiilor V600 în gena BRAF în cancerul colorectal:

• obținerea unui rezultat concret, în timp scurt;
• diagnosticare timpurie a cancerului colorectal;
• stabilirea unui diagnostic de certitudine – CRC sporadic vs. CRC ereditar (sindrom Lynch);
• identificarea opțiunilor terapeutice compatibile cu profilul molecular al tumorii, inclusiv excluderea terapiei cu anticorpi monoclonali anti-EGFR la pacienții BRAF V600E pozitivi;
• monitorizarea periodică a pacienților CRCm pozitivi pentru detecția precoce a progresiei bolii și adaptarea tratamentului;
• furnizarea de informații privind prognosticul bolii (evoluție agresivă, rată de supraviețuire redusă).

Particularități

Detecția mutațiilor în gena BRAF se realizează prin metoda Real-Time PCR, o tehnică moleculară precisă și relativ simplă, care prezintă următoarele caracteristici:

• Cost redus și timp scurt de analiză, comparativ cu tehnologia NGS (Next-Generation Sequencing);
• Sensibilitate crescută – permite amplificarea chiar și a unor cantități reduse de ADN, aspect esențial în analiza probelor provenite din țesut tumoral inclus în parafină, unde materialul genetic este adesea limitat;
• Specificitate ridicată pentru mutațiile analizate – asigură detecția variantelor prezente într-o proporție redusă în proba tumorală;
• Robustețe – metoda oferă rezultate fiabile chiar și atunci când calitatea ADN-ului genomic tumoral este suboptimă, fiind ideală pentru probele FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded), unde predomină fragmentele scurte de ADN;
• Limită de detecție scăzută – permite identificarea variantelor cu frecvențe alelice reduse (până la 1% ADN mutant într-un fundal de 99% ADN normal), inclusiv în biopsii cu conținut tumoral scăzut.

Limitări

• Testarea vizează în principal mutațiile V600; variantele non-V600 pot necesita analize suplimentare prin metode complementare (ex. NGS);
• Nu permite detecția tuturor mutațiilor rare ale genei BRAF și nici a altor mecanisme de rezistență la terapiile țintite;
• Probele de calitate redusă – material tisular insuficient, procent tumoral <2%, concentrație ADN <1 ng sau ADN degradat în urma procesului de includere în parafină – pot genera date de calitate inferioară, improprii obținerii unui rezultat concludent;
• Rezultatele negative (mutații nedetectate) nu exclud prezența unor mutații care nu sunt incluse în kitul utilizat pentru testare.

Recoltare și condiții:

Testul se realizează pe sectiuni de tesut inclus în parafină (FFPE),în general cu grosimea de 5 microni,și etalate pe lama microscopică, fără a fi colorate prin coloratia clasică cu hematoxilin-eozina. Medicul anatomo-patolog indică o zona cu celularitate tumorală crescută, si cu zone de necroză, fibroză sau infiltrat inflamator cât mai reduse, de unde se va efectua extractia de ADN. Testarea genetică pentru detectia mutatiilor in gena BRAF, se realizează prin metoda Real-Time PCR.

Analize asociate recomandate

• Panel genetic somatic cancer colon din biopsie lichida – 14 gene
• Panel genetic somatic cancer colorectal [COLO1]
• Panel genetic somatic cancer colorectal [COLO2]
• Panel genetic somatic pan-cancer din biopsie lichida – 52 gene
• Panel 52 gene relevante in tumori solide Oncomine Focus Assay ADN + ARN